P34

SERUM LEPTIN  AFFECTS THE GEOMETRICAL BUT NOT BIOMECHANICAL PROPERTIES OF FEMORAL DIAPHYSIS IN YOUNG RATS WITH EXPERIMENTAL CHRONIC RENAL FAILURE

Pawlak K.¹, Znorko B.¹, Oksztulska-Kolanek E.¹, Domaniewski T.¹, Rogalska J.², Brzóska M.M.², Pawlak D³

¹Zakład Farmakoterapii Monitorowanej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

²Zakład Toksykologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

³Zakład Farmakodynamiki, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

Key words: chronic renal failure, leptin,  bone geometry, bone  biomechanical properties

Objectives. Patients with chronic kidney disease mineral and bone disorder (CKD-MBD) suffer from bone disease characterized by decreased bone quantity and quality starting early during the course of CKD. CKD-MBD may also be characterized by impaired bone strength and geometry leading to an increased incidence of low-trauma fractures. Leptin is a small polypeptide hormone produced in fat tissue that plays an important role in controlling bone metabolism. It is a potent inhibitor of bone formation acting indirectly through the central nervous system. However, leptin also acts as a local factor produced by osteoblasts, with the ability to modulate bone resorption and formation through direct effects on bone cells.

Aim. We used the experimental 5/6 nephrectomy model of chronic renal failure (CRF) to explain, if serum leptin levels can affect bone geometrical and biomechanical properties in young, growing rats

Material and methods. Forty 4 weeks-old Wistar male rats were randomly allocated to sham-operation (Controls, n=16) or 5/6 nephrectomy (CRF, n=24). After one (CRF1) and three months (CRF3) of CFR development the animals were sacrificed, serum samples were collected and femurs were excised for three-point bending test.

Results. Serum leptin concentrations were significantly lower in CRF in comparison with controls after 1 month (p<0.05) and particularly after 3 months (p<0.01) of CRF development. After adjusting for body weight, the values of: femoral weight, length, the anterior-posterior periosteal and endosteal diameters, the medial-lateral periosteal and endosteal diameters, cortical wall thickness (WT), cortical index (CI),  cross-sectional area (CSA),  cross-sectional moment of inertia (CSMI) and mean relative wall thickness (MRWT) were significantly greater in femurs from the CRF rats compared to the controls. These  differences were particularly seen in the third month of disease progression. Yield load (F_y)  has been significantly decreased, whereas work to failure (W) and yield stress (ϭ_y) were increased in the femurs of CRF rats compared to controls. In controls, serum leptin was strongly and inversely associated with the majority of femoral geometrical parameters (except CSMI). In CRF, the inverse association was only observed between leptin and the femoral diameters. There was no association between leptin levels and biomechanical properties of femur in CRF as well as in control rats.

Conclusions. In young, rapidly growing rats serum leptin affects bone geometrical but not biomechanical properties in controls as well as in experimental chronic renal failure. However, in CRF rats with reduced leptin concentrations, this effect was less pronounced than in healthy animals.

P34

LEPTYNA MODYFIKUJE GEOMETRIĘ KOŚCI UDOWEJ BEZ WPŁYWU NA JEJ WŁAŚCIWOŚCI BIOMECHANICZNE W MODELU PRZEWLEKŁEJ NIEWYDOLNOŚCI NEREK U MŁODYCH SZCZURÓW

Pawlak K.¹, Znorko B.¹, Oksztulska-Kolanek E.¹, Domaniewski T.¹, Rogalska J.², Brzóska M.M.², Pawlak D³.

¹Zakład Farmakoterapii Monitorowanej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

²Zakład Toksykologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

³Zakład Farmakodynamiki, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

Słowa kluczowe: przewlekła niewydolność nerek, leptyna, geometria kości, właściwości biomechaniczne kości

P35

STOSOWANIE UROSELEKTYWNYCH Ρ1A-ADRENOLITYKÓW ZAPOBIEGA ZABURZENIOM PRZEBUDOWY KOŚCI WYWOŁANYM ORCHIDEKTOMIĄ U SZCZURÓW

Miozga R., Cegieła U., Pytlik M., Piskorz S.

Katedra i Zakład Farmakologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

Słowa kluczowe: uroselektywne α1A-adrenolityki, właściwości mechaniczne kości, tamsulosyna, silodosyna, szczury orchidektomizowane, niedobór androgenów

Wstęp. Wpływ współczulnego układu nerwowego na kości wiąże się głównie z aktywacją lub blokowaniem receptorów β-adrenergicznych, zwłaszcza podtypu β2. Badania in vitro dowodzą jednak, że także receptory α1-adrenergiczne (α1-AR) pełnią ważną rolę w regulacji wzrostu i funkcjonowania osteoblastów, a leki aktywujące α1-AR mogą wpływać na przebudowę kości w sposób zależny od rytmu okołodobowego. W tym badaniu wykazano, że blokada α1A-AR wpływa na przebudowę kości w sposób zależny od poziomu androgenów.

Cel. Celem pracy było zbadanie wpływu tamsulosyny i silodosyny, uroselektywnych antagonistów α1A-AR, na przebudowę kości u szczurów z obecnością oraz z deficytem androgenów wywołanym orchidektomią.

Materiał i metody. Trzymiesięczne szczury szczepu Wistar były orchidektomizowane (ORX) lub operowane pozornie (Sham) w znieczuleniu ogólnym ketaminą i ksylazyną, a po 7 dniach zostały podzielone na sześć grup (n=10): szczury kontrolne operowane pozornie, szczury operowane pozornie otrzymujące tamsulosynę lub silodosynę, szczury kontrolne orchidektomizowane, szczury orchidektomizowane otrzymujące tamsulosynę lub silodosynę. Tamsulosyna (0,1 mg/kg) i silodosyna (0,3 mg/kg) były podawane dożołądkowo sondą raz dziennie, przez 9 tygodni (6 dni w tygodniu). Masa kości i minerału, zawartość wapnia i fosforu w minerale kostnym, parametry histomorfometryczne w kości zbitej i gąbczastej, poziomy osteokalcyny i C-końcowych telopeptydów kolagenu typu I w surowicy krwi, właściwości mechaniczne przynasady kości piszczelowej oraz trzonu i szyjki kości udowej były oceniane po 10. tygodniach od wykonania operacji ORX lub Sham.

Wyniki. Niedobór androgenów wywołany orchidektomią zwiększał tempo obrotu metabolicznego kości nasilając resorpcję kości gąbczastej i zbitej. W kości gąbczastej istotnie zmniejszyła się szerokość beleczek kostnych w nasadzie i przynasadzie kości udowej, a w kości zbitej przyrost trzonu kości piszczelowej od okostnej i jamy szpikowej oraz powierzchnia kości korowej. Efektem wzrostu resorpcji było istotne zmniejszenie masy minerału, zawartości wapnia i fosforu w kościach oraz istotne osłabienie właściwości mechanicznych przynasady kości piszczelowej i trzonu kości udowej.

Wpływ tamsulosyny i silodosyny na przebudowę kości był zależny od poziomu androgenów. Stosowanie tamsulosyny lub silodosyny u szczurów z obecnością androgenów nie wpływało istotnie na przebudowę kości, natomiast u szczurów orchidektomizowanych przeciwdziałało zmianom indukowanym niedoborem androgenów zapobiegając pogorszeniu właściwości mechanicznych kości gąbczastej i zbitej. Działanie prewencyjne silodosyny było silniejsze niż tamsulosyny i korelowało z selektywnością blokowania α1A-AR.

Wnioski. Podsumowując, blokada α1A-AR przez tamsulosynę lub silodosynę zapobiegała zaburzeniom przebudowy kości indukowanym niedoborem androgenów u szczurów.

P35

ADMINISTRATION OF UROSELECTIVE Ρ1A-BLOCKERS PREVENT DISORDERS OF BONE REMODELING INDUCED BY ORCHIDECTOMY IN RATS

Miozga R., Cegieła U., Pytlik M., Piskorz S.

Katedra i Zakład Farmakologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

Key words: uroselective α1A-blokers, bone mechanical properties, tamsulosin, silodosin, orchidectomized rats, androgen deficiency

Objectives. The effect of the sympathetic nervous system on bone is mainly related to the activation or blocking of β-adrenergic receptors, especially of β2 subtype. However, in vitro studies show that α1-adrenergic receptors (α1-AR) also play an important role in the regulation of growth and function of osteoblasts, and the drugs activating α1-AR may affect bone remodeling in a manner dependent on the circadian rhythm. It is demonstrated in the present study, that α1A-AR blockade affects bone remodeling in a manner dependent on the level of androgens.

Aim. The aim of the present study was to investigate the effect of tamsulosin and silodosin, uroselective α1A-AR antagonists, on bone remodeling in rats with the presence of androgens and with androgen deficiency induced by orchidectomy.

Materials and methods. Three-month-old Wistar rats were orchidectomized (ORX) or sham-operated under ketamine-xylazine anesthesia, and, after 7 days, divided into 6 groups (n=10): sham-operated control rats, sham-operated rats receiving tamsulosin or silodosin, orchidectomized control rats, orchidectomized rats receiving tamsulosin or silodosin. Tamsulosin (0.1 mg/kg) and silodosin (0.3 mg/kg) were administered by a gastric tube once daily, for 9 weeks (6 days a week). Bone mass and mineral mass, calcium and phosphorus content in the bone mineral, histomorphometric parameters of compact and cancellous bone, serum osteocalcin and C-terminal telopeptide of collagen type I levels, and mechanical properties of the tibial metaphysis and femoral diaphysis and neck were determined after 10 weeks of ORX or sham operation.

Results. Androgen deficiency induced by orchidectomy increased the bone turnover rate, increasing the resorption of cancellous and compact bone. In cancellous bone, the trabeculae width in the epiphysis and metaphysis of the femur, and in compact bone, the growth on the periosteal and marrow cavity side and the marrow cavity area in the tibia significantly decreased. The increase in bone resorption resulted in a significant decrease in the mass of mineral, and calcium and phosphorus content in the bone mineral, as well as significant weakening of mechanical properties of the tibial metaphysis and femoral diaphysis.

The effect of tamsulosin and silodosin on bone remodeling was dependent on the level of androgens. The use of tamsulosin or silodosin in rats with the presence of androgens did not significantly affect bone remodeling, whereas it counteracted the effects induced by androgen deficiency, preventing deterioration of mechanical properties of cancellous and compact bone. The preventive effect of  silodosin was stronger than that of tamsulosin, and correlated with a selectivity of α1-AR blockade.

Conclusions. In conclusion, blockade of α1A-AR by tamsulosin or silodosin prevented bone remodeling disorders induced by androgen deficiency in rats.

P36

THE IMPACT OF EXPERIMENTAL CHRONIC RENAL FAILURE ON BIOMECHANICAL PROPERTIES OF FEMUR IN GROWING RATS

Domaniewski T.¹, Oksztulska-Kolanek  E.¹, Znorko  B.¹, Pawlak  D.², Brzóska  M.³, Pawlak  K.¹

¹Zakład Farmakoterapii Monitorowanej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

²Zakład Farmakodynamiki, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

³Zakład Toksykologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

Key words: chronic renal failure, bone biomechanical properties, secondary hyperparathyroidism

Objectives. Disruptions in mineral metabolism occur early in the course of chronic kidney disease (CKD) and result in alterations in bone mass, turnover, mineralization, and architecture that are the main elements of bone strength. Decreases in bone strength manifest clinically as fractures, and bone strength has been recognized as a key component of CKD-Mineral and Bone Disorder (CKD-MBD). Bone strength can be directly measured by a biomechanical analysis of the bone from animal experimental models, however, the information about bone biomechanical properties in CKD is scarce.

Aim. We used the experimental 5/6 nephrectomy model of chronic renal failure (CRF) to perform the comprehensive study explaining the impact of age, disease progression  and secondary hyperparathyroidism on biomechanical properties of femurs in growing rats.

Materials and methods. Forty 4 weeks-old Wistar male rats were randomly allocated to sham-operation (Controls, n=16) or 5/6 nephrectomy (CRF, n=24). After one and 3 months of CFR progression the animals were sacrificed, serum samples were collected, and femurs were excised for three-point bending test.

Results. The mean body weights and serum calcium levels were lower, whereas creatinine, urea and parathyroid hormone (PTH) levels were higher in CRF in comparison with appropriate controls. After adjusting for body weight, the yield load (Fy) was significantly reduced in the early stage of CRF compared to controls, however, its values increased with the development of disease.  The stiffness and work to fracture (W) were increased in CRF compared to control rats. Moreover, the part of femoral material properties – yield stress (σy)  was significantly higher in CRF groups compared to controls. The positive relationship was between the cross-sectional moment of inertia (CSMI) and femoral Fu, Fy, and stiffness. Serum PTH levels positively correlated with femoral Fy, Fu, stiffness and CSMI in CRF but not in the controls.

Conclusions. The femoral strength in growing rats with CRF were even better than those in age-matched controls. It is possible that an early adaptive response related to rapidly growth provided protection from the deleterious effects of CRF on bone. PTH levels seems to be one of the possible factors responsible for this protective mechanism.

P36
WPŁYW EKSPERYMENTALNEJ, PRZEWLEKŁEJ NIEWYDOLNOŚCI NEREK NA WŁAŚCIWOŚCI BIOMECHANICZNE KOŚCI UDOWEJ U ROSNĄCYCH SZCZURÓW

Domaniewski T.¹, Oksztulska-Kolanek  E.¹, Znorko  B.¹, Pawlak  D.², Brzóska  M.³, Pawlak  K.¹

¹Zakład Farmakoterapii Monitorowanej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

²Zakład Farmakodynamiki, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

³Zakład Toksykologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

Słowa kluczowe: przewlekła niewydolność nerek, właściwości biomechaniczne kości, wtórna nadczynność przytarczyc

VI Środkowo Europejski Kongres Osteoporozy i Osteoartrozy oraz XVII Zjazd Polskiego Towarzystwa Osteoartrologii i Polskiej Fundacji Osteoporozy, Kraków 25-26.09.2015

P37
THE BONE TURNOVER MARKERS IN SERUM AND BONE TISSUE IN YOUNG RATS WITH EXPERIMENTAL CHRONIC RENAL FAILURE

Znorko B., Oksztulska-Kolanek E., Domaniewski T., Michałowska M., Pawlak D., Rogalska J., Pawlak K.

Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

Key words: chronic renal failure, bone  turnover markers, young rat

Objectives. Chronic Kidney Disease (CKD) is a condition associated with progressive kidney failure and bone disorders. The typical biochemical derangement, including abnormalities in mineral homeostasis and the progress of CKD-mineral and bone disorder (CKD-MBD) frequently occurs in CKD. Biochemical markers reflect the processes involved in bone remodeling. Bone turnover is represented by markers such as: alkaline phosphatase (ALP), an indicator of the bone formation rate, and tartare-resistant acid phosphatase (TRAP), which is regarded as a marker of osteoclastic activity and bone resorption.

Aim. We used the experimental 5/6 nephrectomy model of chronic renal failure (CRF) to explain the impact of age, disease progression and secondary hyperparathyroidism on bone turnover markers in serum and femoral tissue of young growing rats.

Materials and methods. One-month-old Wistar male rats were randomly allocated into 5/6 nephrectomy and sham operation. Serum samples and femurs were collected one and three months after surgery. Bone turnover markers activity was measured in serum (sALP, sTRAP), trabecular (tALP, tTRAP) and cortical (cALP, cTRAP) femoral tissue. Next, the TRAP/ALP ratios, reflecting the predominance of bone resorption process, have been calculated. Moreover, serum parathyroid hormone (PTH) and creatinine concentrations were measured.

Results. PTH and creatinine levels were higher in CRF in comparison with appropriate controls. sALP, sTRAP and sTRAP/ALP ratio were similar in CRF and controls, however the age-dependent reduction in sALP was observed in all animals. tALP was significantly decreased in CRF animals compared to controls, and its age-dependent reduction was also observed. tTRAP was significantly higher in CRF compared to controls after one month of CRF development, and tTRAP/ALP ratio were significantly higher in CRF than in healthy animals. There were not differences in cALP, cTRAP and cTRAP/ALP ratio between CRF and controls. sALP was inversely associated with PTH and creatinine levels both in CRF and in controls. sALP correlated with tALP in CRF rats, and the positive association was between ALP and TRAP in trabecular but not in cortical tissue. Moreover, tALP and tTRAP were inversely associated with PTH and creatinine levels in CRF rats. There was no correlation between trabecular and cortical markers of bone turnover both in CRF and controls. However, in healthy animals the positive relationship between cALP and cTRAP was observed.

Conclussions. The disturbances of bone turnover with a predominance of resorption were observed in trabecular bone of CRF rats. The uncoupling bone turnover existed between trabecular and cortical bone both in CRF and controls, which may be explained by modeling process dominant in rapidly growing rats. The factors associated with renal insufficiency adversely affected bone turnover in trabecular tissue of CRF rats.

P37

MARKERY OBROTU KOSTNEGO W SUROWICY ORAZ TKANCE KOSTNEJ U MŁODYCH SZCZURÓW Z EKSPERYMENTALNĄ PRZEWLEKŁĄ NIEWYDOLNOŚCIĄ NEREK

Znorko B., Oksztulska-Kolanek E., Domaniewski T., Michałowska M., Pawlak D., Rogalska J., Pawlak K.

Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

Słowa kluczowe: przewlekła niewydolność nerek, markery obrotu kostnego, młody szczur

P38

THE EFFECT OF PERIPHERAL SEROTONINE PATHWAY ON BONE BIOMECHANICAL PARAMETERS IN RATS WITH EXPERIMENTAL CHRONIC RENAL FAILURE.

Oksztulska-Kolanek E.¹, Pawlak D.², Znorko B.¹, Domaniewski T.¹, Michałowska M.², Brzóska MM.³, Pawlak K.¹

¹Zakład Farmakoterapii Monitorowanej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

²Zakład Farmakodynamiki, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

³Zakład Toksykologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

Key words: serotonin, 5-hydroxyindole acetic acid, biomechanical testing 

Objectives. Serotonin (5-HT) is a neuropeptide, which plays an important role in bone metabolism. There are two types of serotonin, which exert antagonistic effects depending on its sites of synthesis. When serotonin is produced peripherally via duodenum cells, it acts as a hormone to inhibit bone formation.  In contrast, when produced in the brain, this amine acts as a neurotransmitter enhancing bone formation and inhibition of bone resorption.

Aim. The aim of the study was to assess the impact of changes in peripheral 5HT and its metabolite – 5-hydroxyindoleacetic acid (5HIAA) concentrations on biomechanical parameters of the femur in rats with experimental chronic renal failure (CRF).

Material and methods. Forty one month-old Wistar male rats were randomly allocated into subtotal nephrectomy and sham operation. Blood samples and bones were collected one and three months after surgery, respectively. The concentration of 5-HT and 5HIAA was determined using HPLC. Left femurs was dissected and stored until biomechanical testing. The biomechanical properties of the left femur were measured using three-point-bending test. The biomechanical properties were determined by following parameters: S= stiffness; F_y=yield load; dl(F_y)=displacement at the yield point; F_u=ultimate load; dl(F_u)=displacement at fracture; W=work to fracture; E=Young modulus, σ_y=yield stress and σ_u=ultimate stress.

Results. The results indicate a statistically significant increase in levels of serotonin and its metabolite 5HIAA in serum of rats with CRF compared to the corresponding control groups. After adjusting for body weight, we observed an increase following parameters: dl (F_u), W, stiffness and σ_y in CRF rats in comparison to control groups. Conversely, F_y was significantly reduced in the early stage of CRF compared to controls, however, its values increased with the development of disease. The positive correlation was between 5-HT and 5 HIAA levels, while these parameters were inversely related to bone stiffness. Both 5-HT and 5HIAA were positively associated with dl(F_u). Moreover, 5HIAA positively  correlated with W, E, and σ_u, and the tendency to positive relationship was observed between 5-HT and σ_u.

Conclusions. As a consequence of CRF, the elevation in the peripheral serotonin pathway metabolites occur, which resulting in decreased bone stiffness. Simultaneously, 5-HT and particularly 5HIAA seem to have beneficial effect on bone plasticity and bone material properties.

P38

Wpływ obwodowego układu serotoninergicznego na parametry biomechaniczne kości szczurów z eksperymentalną przewlekłą niewydolnością nerek

Oksztulska-Kolanek E.¹ Pawlak D.² Znorko B.¹, Domaniewski T.¹, Michałowska M.², Brzóska MM.³ Pawlak K.¹

¹Zakład Farmakoterapii Monitorowanej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

²Zakład Farmakodynamiki, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

³Zakład Toksykologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

Słowa kluczowe: serotonina, kwas 5-hydroksyindolooctowy, testy biomechaniczne

P39

NEBIWOLOL ZAPOBIEGA ROZWOJOWI OSTEOPOROZY U OWARIEKTOMIZOWANYCH SZCZURÓW

Pytlik M., Janas A., Folwarczna J., Cegieła U., Śliwiński L., Gryboś A. 

Katedra i Zakład Farmakologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

Słowa kluczowe: nebiwolol, osteoporoza, owariektomizowane szczury, kości

Wstęp. Niedobór estrogenów u kobiet po menopauzie sprzyja rozwojowi osteoporozy oraz chorób układu sercowo-naczyniowego, a zwłaszcza nadciśnienia tętniczego. W terapii nadciśnienia tętniczego często stosuje się leki β-adrenolityczne. Nebiwolol jest selektywnym β1-adrenolitykiem nowej generacji, który w wyniku aktywacji śródbłonkowej syntazy tlenku azotu (eNOS) i syntezy NO wykazuje jednoczesne działanie wazodylatacyjne. Wcześniej opublikowane wyniki badań oddziaływania leków β-adrenolitycznych na tkankę kostną zwierząt eksperymentalnych i ludzi są sprzeczne, a wpływ nebiwololu na przebudowę tkanki kostnej w warunkach rozwijającej się osteoporozy nie był badany.

Cel. Celem pracy było zbadanie wpływu nebiwololu na wzrost i przebudowę tkanki kostnej u owariektomizowanych szczurów.

Materiał i metody. Badania przeprowadzono na 3-miesięcznych samicach szczurów szczepu Wistar, które podzielono na 4 grupy (n=9-10 w grupie): I – szczury kontrolne pozornie operowane (Sham), II – szczury kontrolne owariektomizowane, (OVX), III – szczury owariektomizowane, którym podawano nebiwolol w dawce 1 mg/kg po (OVX+N1), IV – szczury owariektomizowane, którym podawano nebiwolol w dawce 10 mg/kg po (OVX+N10). Obustronną owariektomię i operację pozorną wykonano 7 dni przed stosowaniem leku. Szczurom grup kontrolnych podawano wodę, natomiast szczurom grup III i IV nebiwolol w postaci wodnej zawiesiny, w objętości 2 ml/kg sondą dożołądkową codziennie przez 28 dni.

Wzrost i przebudowę tkanki kostnej oceniano w oparciu o badania makrometryczne (długość i średnicę w połowie długości kości piszczelowej i udowej) oraz histomorfometryczne obejmujące oznaczenia w trzonie kości piszczelowej i udowej (przyrostu kości na grubość, szerokości osteoidu od strony okostnej i śródkostnej, powierzchni przekroju poprzecznego trzonu, kory i jamy szpikowej) oraz w nasadzie i przynasadzie kości udowej (szerokości beleczek kostnych) i szerokości chrząstki nasadowej. Badano także masę kości, masę substancji mineralnych, stosunek masy substancji mineralnych/masy kości, zawartość wapnia i fosforu w zmineralizowanych kościach piszczelowych, udowych i w kręgach L-4 oraz stężenie wapnia, fosforu i cholesterolu w surowicy krwi.

Wyniki. Uzyskane wyniki wykazały, że niedobór estrogenów u szczurów obustronnie owariektoimizowanych spowodował znaczący wzrost procesów przebudowy kości z intensyfikacją resorpcji i kościotworzenia oraz zaburzeniem mineralizacji. Nebiwolol w dawce 1 mg/kg po nie zmieniał statystycznie znacząco wzrostu i przebudowy tkanki kostnej, natomiast w dawce 10 mg/kg po poprzez nasilenie procesów kościotworzenia zapobiegał rozwojowi zmian wywołanych deficytem estrogenów w wyniku obustronnej owariektomii u szczurów.

Wnioski. Podsumowując, uzyskane wyniki w modelu zwierzęcym osteoporozy sugerują, że nebiwolol stosowany w leczeniu nadciśnienia tętniczego oraz innych schorzeń układu krążenia u kobiet po menopauzie może wykazywać korzystny wpływ na procesy przebudowy kości i zmniejszać ryzyko rozwoju osteoporozy.

P39

NEBIVOLOL COUNTERACTS THE DEVELOPMENT OF OSTEOPOROSIS IN OVARIECTOMIZED RATS

Pytlik M., Janas A., Folwarczna J., Cegieła U., Śliwiński L., Gryboś A.

Katedra i Zakład Farmakologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

Key words: nebivolol, osteoporosis, owariectomized rats, bone

Objectives. Estrogen deficiency in postmenopausal women favors the development of osteoporosis and diseases of the cardiovascular system, especially hypertension. In the treatment of hypertension, β-blockers are often used. Nebivolol is a selective β1-blocker of new generation. Nebivolol, due to activation of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and the synthesis of NO, simultaneously exerts vasodilatory action. The previously published studies on the impact of β-blockers on the bone tissue of experimental animals and humans are conflicting, and the effect of nebivolol on bone remodeling in conditions of developing osteoporosis has not been studied.

Aim. The aim of the present study was to investigate the effect of nebivolol on bone growth and remodeling in ovariectomized rats.

Materials and methods. The experiments were performed on 3-month-old female Wistar rats, divided into 4 groups (n = 9-10 per group): I – Sham-operated control rats (Sham), II – Ovariectomized control rats (OVX), III – Ovariectomized rats administered nebivolol 1 mg/kg po (OVX + N1), IV – Ovariectomized rats administered nebivolol 10 mg/kg po (OVX + N10). Bilateral ovariectomy and sham operation was performed 7 days before the start of drug administration. The control rats were administered water, and rats of III and IV groups received nebivolol in the form of an aqueous suspension, by a stomach gavage, in a volume of 2 ml/kg, once daily for 28 days.

Bone growth and remodeling were assessed based on the macrometric (length and diameter in the half-length of the tibia and femur) and histomorphometric studies, including determination of bone transverse growth and osteoid width on the periosteal and endosteal side, cross-sectional area of the marrow cavity and cortical bone in the tibial and femoral diaphysis, as well as of the width of epiphyseal cartilage and trabeculae in the femoral epiphysis and metaphysis. Bone mass, bone mineral mass, and bone mineral mass/bone mass ratio, content of calcium and phosphorus in the bone mineral of the tibia, femur and L-4 vertebra, and serum levels of calcium, phosphorus and cholesterol were also investigated.

Results. The results showed that estrogen deficiency in bilaterally ovariectomized rats caused a significant increase in bone remodeling processes, with the intensification of bone resorption and bone formation, and mineralization disorders. Nebivolol at a dose 1 mg/kg po did not statistically significantly affect bone growth and remodeling, whereas, at a dose of 10 mg/kg po, nebivolol prevented the development of changes induced by estrogen deficiency, intensifying the processes of bone formation.

Conclusions. In conclusion, the results, obtained in an animal model of osteoporosis, suggest that nebivolol used in the treatment of hypertension and other cardiovascular diseases in post-menopausal women may have beneficial effects on bone remodeling processes and reduce the risk of development of osteoporosis.

P40

WPŁYW WYCIĄGU Z WIERZBOWNICY DROBNOKWIATOWEJ NA WŁAŚCIWOŚCI MECHANICZNE KOŚCI U SZCZURÓW

Piskorz S., Cegieła U., Pytlik M., Śliwiński L., Miozga R.

Katedra i Zakład Farmakologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

Słowa kluczowe: właściwości mechaniczne kości, wyciąg z wierzbownicy drobnokwiatowej, szczury orchidektomizowane, niedobór androgenów

Wstęp. Łagodny rozrost gruczołu krokowego (BPH – bening prostatic hyperplasia) jest jedną z najczęstszych chorób rozwijających się, podobnie jak osteoporoza inwolucyjna, wraz z wiekiem u mężczyzn. Za podstawową w profilaktyce oraz wspomagającą klasyczną farmakoterapię BPH uznaje się fitoterapię. Do najczęściej stosowanych należą leki zawierające ekstrakty z dojrzałych owoców palmy sabalowej (Serenoa repens) i kory śliwy afrykańskiej (Pygenum africanum), a obecnie także z wierzbownicy drobnokwiatowej (Epilobium parviflorum). Ich działanie antyandrogenowe związane z hamowaniem 5α-reduktazy oraz przeciwzapalne, wynikające z obniżenia aktywności enzymów pozapalnych i stężenia prostaglandyn, przypisuje się głównie frakcji lipidowo-sterolowej ekstraktów zawierającej fitosterole, głównie β-sitosterol i oenoteinę B.

Cel. Celem pracy było zbadanie wpływu wyciągu z wierzbownicy drobnokwiatowej na właściwości mechaniczne kości u szczurów z obecnością oraz z deficytem androgenów wywołanym orchidektomią.

Materiał i metody. Trzymiesięczne szczury szczepu Wistar były orchidektomizowane (ORX) lub operowane pozornie (Sham) w znieczuleniu ogólnym ketaminą i ksylazyną, a po 7. dniach zostały podzielone na sześć grup (n=10): szczury kontrolne operowane pozornie, szczury operowane pozornie otrzymujące wyciąg z wierzbownicy drobnokwiatowej w dawce 50 lub 100 mg/kg, szczury kontrolne orchidektomizowane, szczury orchidektomizowane otrzymujące wyciąg z wierzbownicy drobnokwiatowej w dawce 50 lub 100 mg/kg. Wyciąg z wierzbownicy drobnokwiatowej był podawany dożołądkowo sondą raz dziennie, przez 7 tygodni (6 dni w tygodniu). Właściwości mechaniczne przynasady kości piszczelowej oraz trzonu i szyjki kości udowej, a także masa kości i minerału były oceniane po 8 tygodniach od wykonania operacji ORX lub Sham.

Wyniki. Niedobór androgenów wywołany orchidektomią istotnie zmniejszał masę kości i minerału, powodując istotne osłabienie właściwości mechanicznych przynasady kości piszczelowej oraz szyjki i trzonu kości udowej.

Wpływ wyciągu z wierzbownicy drobnokwiatowej na kości był zależny od poziomu androgenów. Stosowanie wyciągu z wierzbownicy drobnokwiatowej u szczurów orchidektomizowanych przeciwdziałało zmianom indukowanym niedoborem androgenów zapobiegając pogorszeniu właściwości mechanicznych przynasady kości piszczelowej i szyjki kości udowej oraz zmniejszało niekorzystny wpływ orchidektomii na właściwości mechaniczne trzonu kości udowej. Natomiast u szczurów z obecnością androgenów nie wpływało istotnie na właściwości mechaniczne badanych kości.

Wnioski. Podsumowując, stosowanie wyciągu z wierzbownicy drobnokwiatowej wpływa korzystnie na właściwości mechaniczne kości u szczurów z niedoborem androgenów.

P40

EFFECTS OF EPILOBIUM PARVIFLORUM EXTRACT ON BONE MECHANICAL PROPERTIES IN RATS

Piskorz S., Cegieła U., Pytlik M., Śliwiński L., Miozga R.

Katedra i Zakład Farmakologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

Key words: bone mechanical properties, Epilobium parviflorum extract, orchidectomized rats, androgen deficiency

Objectives. Benign prostatic hyperplasia (BPH) is one of the most common diseases, developing, similarly to involutional osteoporosis, with age in men. Phytotherapy is used in the BPH prophylaxis, and, supportively, during its classical pharmacological treatment. Drugs containing extracts of the ripe fruit of saw palmetto (Serenoa repens) and the bark of African plum (Pygenum africanum), and now also Epilobium parviflorum extract, belong to the most commonly used ones. Their antiandrogenic action related to the inhibition of 5α-reductase and anti-inflammatory activity resulting from a reduction of activity of pro-inflammatory enzymes and concentration of prostaglandins, are mainly attributed to the lipid-sterol fraction of the extracts, which contains phytosterols, mainly β-sitosterol and oenothein B.

Aim. The aim of the present study was to investigate the effect of the extract of Epilobium parviflorum on bone mechanical properties in rats with the presence of androgens and in androgen deficit induced by orchidectomy.

Materials and methods. Three-month-old Wistar rats were orchidectomized (ORX) or sham-operated (Sham) under ketamine-xylazine anesthesia, and, after 7 days, divided into 6 groups (n=10): sham-operated control rats, sham-operated rats receiving the extract from Epilobium parviflorum at a dose of 50 or 100 mg/kg, orchidectomized control rats, orchidectomized rats receiving the extract from Epilobium parviflorum at a dose of 50 or 100 mg/kg. The extract was administered by a gastric tube once daily, for 7 weeks (6 days a week). Bone mechanical properties of the tibial metaphysis and femoral diaphysis and neck, and mass of bone and bone mineral, were determined after 8 weeks of ORX or sham operation.

Results. Androgen deficiency induced by orchidectomy significantly reduced mass of bone and bone mineral, causing significant weakening of mechanical properties of the tibial metaphysis and the femoral neck and diaphysis.

The effect of the extract of Epilobium parviflorum bone was dependent on the level of androgens. Administration of the extract of Epilobium parviflorum counteracted the changes induced by androgen deficiency in orchidectomized rats, preventing the worsening of the mechanical properties of the tibial metaphysis and femoral neck, and reduced the unfavorable impact of orchidectomy on mechanical properties of the femoral diaphysis. However, in rats with the presence of androgens, it did not significantly affect mechanical properties of the examined bones.

Conclusions. In conclusion, the use of the extract of Epilobium parviflorum favorably affects bone mechanical properties in rats with androgen deficiency.

P41

DISTURBANCES OF BRAIN SEROTONIN METABOLISM AFFECT THE BIOMECHANICAL PROPERTIES OF FEMORAL DIAPHYSIS IN RATS WITH EXPERIMENTAL CHRONIC RENAL FAILURE

Pawlak D.¹, Oksztulska-Kolanek E.², Znorko B.², Domaniewski T.², Roszczenko A.³, Brzóska M.M.³, Pawlak K¹.

¹Zakład Farmakodynamiki,

²Zakład Farmakoterapii Monitorowanej,

³Zakład Toksykologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

Key words: chronic renal failure, brain serotonin,  bone biomechanical properties

Objectives. Patients with chronic kidney disease (CKD) are at risk of developing CKD-mineral bone disorder (CKD–MBD). Bone loss occurs even in early stages of CKD, and worsens as renal function declines.  Decrease in bone strength, which clinical manifestation is tendency to fractures, has been recognizes as an important component of CKD-MBD. Serotonin (5-HT) is a bioamine regulating bone mass accrual depending on its site of synthesis – it decreases accrual when synthesized in the gut, and increases it when synthesized in the brain. Brain 5-HT, by binding to its receptor 5-HT_2c on hypothalamic neurons, decreases sympathetic activity and favors bone mass accrual.

Aim. We used the experimental 5/6 nephrectomy model of chronic renal failure (CRF) to perform the study explaining the impact of the hypothalamic serotonin on the biomechanical properties of femoral diaphysis in rat.

Material and methods. Forty 4 weeks-old Wistar male rats were randomly allocated to sham-operation (Controls, n=16) or 5/6 nephrectomy (CRF, n=24). After one (CRF1) and three months (CRF3) of CFR development the animals were sacrificed, their femurs were excised for three-point bending test and hypothalamic tryptophan and 5-HT levels were determined by high pressure liquid chromatography (HPLC).

Results. Hypothalamic TRP concentrations were significantly lower in CRF in comparison with controls after 1 month (p<0.001) and 3 months (p<0.01) of CRF development. 5HT/TRP ratio, reflecting serotoninergic pathway activation, was 6 times higher in CRF1 than in respective controls. 5HT levels were only slightly reduced in CRF1 compared to controls (p<0.05), whereas there was no difference between this hypothalamic monoamine levels between CRF3 and respective controls. However, the age-dependent decrease in serotonin concentrations were observed in CRF as well as in controls. Yield load (F_y)  has been significantly decreased, whereas work to failure (W) and yield stress (ϭ_y) were increased in the femurs of CRF rats compared to controls. Serotonin and 5HT/TRP ratio were inversely associated with F_y and stiffness, whereas they were positively related to displacement at fracture (dl F_u) and ultimate stress (ϭ_u). Moreover, 5HT was positively associated with Young modulus of elasticity (E) in rats with CRF.

Conclusions. Despite the reduced TRP concentration, the synthesis of hypothalamic serotonin is strongly activated in animals with early stage of CRF. Brain serotonin seems to improved the material properties and bone plasticity, whereas it reduces the stiffness of femoral diaphysis in rats with CRF.

P41

Wpływ zaburzeń ośrodkowego metabolizmu serotoniny na biomechaniczne właściwości kości udowej u szczurów z doświadczalną przewlekłą niewydolnością nerek

Pawlak D.¹, Oksztulska-Kolanek E.², Znorko B.², Domaniewski T.², Roszczenko A.³, Brzóska M.M.³, Pawlak K¹.

¹Zakład Farmakodynamiki,

²Zakład Farmakoterapii Monitorowanej,

³Zakład Toksykologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

Słowa kluczowe: przewlekła niewydolność nerek, serotonina w mózgu, właściwości biomechaniczne kości

P42

KURKUMINA STOSOWANA W WYSOKIEJ DAWCE KORZYSTNIE WPŁYWA NA WŁAŚCIWOŚCI MECHANICZNE KOŚCI U SZCZURÓW Z NIEDOBOREM ANDROGENÓW

Sołtysiak P., Cegieła U., Pytlik M., Janas A., Folwarczna J.

Katedra i Zakład Farmakologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

Słowa kluczowe: kurkumina, niedobór androgenów, właściwości mechaniczne kości, szczury

Wstęp. Kurkumina jest polifenolem występującym w kurkumie, sproszkowanym kłączu ostryżu długiego (Curcuma longa L.). Kurkuma stosowana jest od wieków w tradycyjnej medycynie indyjskiej. Kurkumina moduluje aktywność czynników transkrypcyjnych, kinaz białkowych i innych enzymów, cytokin, czynników wzrostu, receptorów i in., z których wiele bierze w regulacji metabolizmu kostnego. Szczególne znaczenie może mieć oddziaływanie kurkuminy na ścieżki sygnałowe zależne od RANKL (w tym na NF-κB) w komórkach osteoklastycznych oraz ścieżkę sygnałową Wnt w komórkach osteoblastycznych. Do działania kurkuminy na układ kostny przyczyniać się może jej działanie antyoksydacyjne. Dotychczas brak jest jakichkolwiek danych na temat działania kurkuminy na układ kostny u ludzi, jednak w warunkach eksperymentalnych wykazano, że kurkumina może hamować rozwój osteoporozy wywołanej niedoborem estrogenów.

Cel. Celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu kurkuminy na właściwości mechaniczne kości u szczurów z niedoborem androgenów wywołanym przez orchidektomię.

Materiał i metody. Badania przeprowadzono na dojrzałych szczurach samcach szczepu Wistar, podzielonych na 4 grupy (n=10): I – szczury kontrolne nieorchidektomizowane, II – szczury kontrolne orchidektomizowane, III – szczury orchidektomizowane, którym podawano kurkuminę w dawce 10 mg/kg p.o. dziennie, IV – szczury orchidektomizowane, którym podawano kurkuminę w dawce 100 mg/kg p.o. dziennie. Zabieg orchidektomii został przeprowadzony w znieczuleniu ogólnym wywołanym ketaminą z ksylazyną u 3-miesięcznych szczurów. Stosowanie kurkuminy rozpoczęto po 4 tygodniach od zabiegu. Kurkuminę podawano sondą dożołądkową, raz dziennie, przez 4 tygodnie. Szczury kontrolne otrzymywały wodę w tej samej objętości (2 ml/kg p.o.). Po 8 tygodniach od orchidektomii zwierzęta uśmiercano. W surowicy oznaczano stężenia markerów metabolizmu kostnego: C-końcowych fragmentów kolagenu typu I uwalnianych podczas resorpcji kości i osteokalcyny. Określano masę prostaty i grasicy, masę i parametry geometryczne kości udowej i piszczelowej oraz badano właściwości mechaniczne trzonu kości udowej (kość zbita) i przynasady bliższej kości piszczelowej (kość gąbczasta) w testach trzypunktowego zginania. Ponadto badano wytrzymałość mechaniczną szyjki kości udowej, zbudowanej z kości zbitej i gąbczastej, z zastosowaniem testu kompresyjnego. Badania wytrzymałościowe przeprowadzono przy użyciu aparatu Instron 3342 500N.

Wyniki. Niedobór androgenów spowodował statystycznie istotne zmniejszenie masy prostaty i zwiększenie masy grasicy. Masa badanych kości uległa zmniejszeniu, resorpcja kości nieznacznie nasiliła się, a właściwości mechaniczne trzonu kości udowej uległy pogorszeniu. Nie stwierdzono statystycznie istotnych zmian właściwości mechanicznych kości gąbczastej.

Podawanie kurkuminy w obydwu dawkach u szczurów z niedoborem androgenów nie wpływało na masę narządów androgenozależnych oraz masę i parametry geometryczne kości. Jednak po stosowaniu kurkuminy w dawce niższej zwiększał się poziom markerów obrotu kostnego i występowała tendencja do poprawy wytrzymałości kości udowej, a w dawce wyższej – istotnie poprawiała się wytrzymałość trzonu kości udowej oraz przynasady kości piszczelowej w porównaniu do zwierząt kontrolnych orchidektomizowanych.

Wnioski. Podsumowując, kurkumina stosowana w wysokiej dawce wywierała korzystny wpływ na układ kostny orchidektomizowanych szczurów, prawdopodobnie działając przez mechanizmy różne od androgenowych.

P42

HIGH-DOSE CURCUMIN FAVORABLY AFFECTS BONE MECHANICAL PROPERTIES IN RATS WITH ANDROGEN DEFICIENCY

Sołtysiak P., Cegieła U., Pytlik M., Janas A., Folwarczna J.

Katedra i Zakład Farmakologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

Key words: curcumin, androgen deficiency, bone mechanical properties, rats

Objectives. Curcumin is a polyphenol present in turmeric, dried ground rhizomes of the turmeric plant (Curcuma longa L.). Turmeric has been used for centuries in the traditional Indian medicine. Curcumin modulates the activity of transcription factors, protein kinases and other enzymes, cytokines, growth factors, receptors and others, many of which take part in regulation of bone metabolism. Of particular importance may be curcumin effects on the pathways dependent on RANKL signaling (including NF-κB) in osteoclastic cells, and Wnt signaling pathway in osteoblastic cells. Antioxidant properties of curcumin may contribute to its skeletal effects. So far there are no data on the effects of curcumin on the skeletal system in humans, but, in experimental conditions, curcumin inhibited development of osteoporosis induced by estrogen deficiency.

Aim. The aim of the present study was to investigate the effect of curcumin on bone mechanical properties in rats with androgen deficiency induced by orchidectomy.

Materials and methods. The experiments were carried out on mature male Wistar rats, divided into 4 groups (n = 10): I – Non-orchidectomized control rats II – Orchidectomized control rats, III – Orchidectomized rats treated with curcumin (10 mg/kg p.o. daily), IV – Orchidectomized rats treated with curcumin (100 mg/kg  p.o. daily). Orchidectomy was performed in 3-month-old rats, under ketamine-xylazine anesthesia. Administration of curcumin started 4 weeks after the surgery. Curcumin was administered, by a stomach tube, once daily for 4 weeks. Control rats received water at the same volume (2 ml/kg p.o.). At 8 weeks after the orchidectomy, the animals were sacrificed. In the serum, markers of bone metabolism: C-terminal fragments of type I collagen released during bone resorption and osteocalcin were determined. The prostate and thymus mass, mass and geometrical parameters of the femur and tibia, and mechanical properties of the femoral diaphysis (compact bone) and tibial proximal metaphysis (cancellous bone), in three-point bending tests, were examined. Moreover, mechanical strength of the femoral neck (built of cortical and cancellous bone) was tested using a compression test. The mechanical tests were performed using an Instron 3342 500N apparatus.

Results. Androgen deficiency resulted in a statistically significant decrease in the prostate mass and an increase in the thymus mass. The mass of the bones decreased, bone resorption slightly intensified and mechanical properties of the femoral diaphysis worsened. There were no statistically significant changes in the mechanical properties of cancellous bone.

Administration of curcumin at both doses to androgen-deficient rats did not affect the mass of androgen-dependent organs, and bone mass and geometrical parameters. However, after administration of curcumin at the lower dose, bone turnover markers increased and there was a tendency to improve the femoral diaphysis strength, and, after the higher dose, there was a significant increase in the strength of the femoral diaphysis and tibial metaphysis in comparison with the orchidectomized control animals.

             Conclusions. In conclusion, curcumin used at a high dose beneficially affected the skeletal system of orchidectomized rats, probably acting through mechanisms different from androgenic ones.

P43

NRF2 TRANSCRIPTION FACTOR AND HEME OXYGENASE-1 AFFECTS OSTEOCLASTS DIFFERENTIATION

Florczyk U., Viscardi M., Nowak W., Józkowicz A., Dulak J.

Jagiellonian University, Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology

Key words: osteoclastogenesis, Nrf2 transcription factor, heme oxygenase-1

Objectives. Due to increased activity and number of osteoclasts (OCLs) there is a progressive demineralization/resorption of bone tissue in diseases associated with inflammation (rheumatoid arthritis) or bone metabolic diseases (osteoporosis). Acting as strong cytoprotectants and antioxidants Nrf2 transcription factor and heme oxygenase-1 (HO-1), its downstream target, have been suggested to play a role in osteoclastogenesis. Nevertheless, the studies investigating the effect of genetic manipulation of those mediators are lacking.

Aim. We aimed to investigate the effect of Nrf2 and HO-1 deficiency on OCL differentiation from bone marrow (BM) cells and specifically from bone marrow macrophages (BMMs).

Materials and methods. As a model Nrf2- or HO-1-knockout mice (Nrf2-/- or HO-1-/-, respectively) and murine monocytic cell line, RAW264.7 were used in combination with pharmacological inducers of HO-1, cobalt protoporphirin IX (CoPPIX) or hemin, as well as siRNA against HO-1.

Results. To test the effect of the absence of Nrf2 and HO-1 in BM cells on osteoclastogenesis, BM cells from Nrf2-/-, HO-1-/- and wild type (WT) mice were counted, seeded in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) to stimulate macrophage growth (day 0 -> day 6) and with receptor activator of nuclear factor kB ligand (RANKL) to induce osteoclasts differentiation (day 3-> day 6). Macrophage phenotype of cells at day 3 was confirmed irrespective of the genotype. Mature OCLs were identified at day 6 by tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) detection. Nrf2 deficiency resulted in higher number of OCLs. Reversely, after Nrf2 activation by sulforaphane in Nrf2+/+ cells no TRAP-positive signal was observed, confirming inhibitory effect of Nrf2. In addition, osteoclasts-specific genes, such as cathepsin K and integrin β3, were upregulated in Nrf2-/- BM cells (vs. Nrf2+/+). In contrast, the lack of HO-1 diminished the number of TRAP+ cells and expression of OCL markers in the population of M-CSF and RANKL-treated BM cells (vs. HO-1+/+). To confirm that the observed effects are not related to the effect of Nrf2/HO-1 on macrophage abundance, BMMs were harvested and plated in equal numbers for all genotypes. Indeed, BMM Nrf2-/- stimulation with RANKL led to a high increase in TRAP-positive cells. BMMs isolated from HO-1-/- mice formed less TRAP+ cells.

In RAW264.7 cells, CoPPIX and hemin both inhibited NFATc-1 and the transfection with siRNA against HO-1 caused similar effect. Therefore, the combination of siRNA HO-1 with CoPP IX was examined. CoPP IX prestimulation resulted in diminishment of NFATc-1 level, while additional siRNA HO-1 transfection tended to reverse this effect- enhanced the expression of NFATc-1.

Conclusions. In summary, Nrf2 deficiency exerts stimulatory effect on osteoclastogenesis, while the lack of HO-1 in BM cells or its silencing in RAW264.7 cells by siRNA decrease this process. On the other hand, HO-1 enhancement by pharmacological inducers also diminished the formation of OCLs, which could be reversed by HO-1 silencing. Those results suggest that HO-1 has to be present at specific level for proper process of osteoclastogenesis.

Supported by Iuventus Plus grant from the Ministry of Science and Higher Education (0244/IP1/2013/72).

P43

CZYNNIK TRANSKRYPCYJNY NRF2 I OKSYGENAZY HEMOWEJ-1 WPŁYWA NA RÓŻNICOWANIE OSTEOKLASTÓW

Florczyk U., Viscardi M., Nowak W., Józkowicz A., Dulak J.

Uniwersytet Jagielloński, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii

Słowa kluczowe: osteoklastogeneza, czynnik transkrypcyjny Nrf2, oksygenaza hemowa-1

P44

CHEMICZNE NANOWŁAŚCIWOŚCI MINERAŁU KOSTNEGO SZYJKI KOŚCI UDOWEJ: BADANIA SPEKTROSKOPIĄ NMR FOSFORU-31 DLA KOBIET Z OSTEOARTROZĄ I OSTEOPOROZĄ LUB OSTEOPENIĄ

Kaflak A.¹, Chmielewski D.², Kołodziejski W.¹

¹Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej, Wydział Farmaceutyczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny

²Department of Orthopaedic Surgery and Traumatology, HOSPITEN Lanzarote

Słowa kluczowe: osteoartroza, osteoporoza, minerał kostny, nanoapatyt, magnetyczny rezonans jądrowy

Wstęp. Minerał kostny zawiera nanocząstki apatytu (płytki o wymiarach poniżej 100 nm), które ulokowane są pomiędzy włóknami kolagenu stanowiącego frakcję organiczną. Nanocząstki te zawierają krystaliczny fosforanowy rdzeń (CPC), który jest otoczony amorficzną uwodnioną warstwą powierzchniową (AHSL). Warstwa powierzchniowa jest relatywnie szeroka i ma istotny wpływ na fizykochemiczne i biologiczne właściwości apatytu kostnego. Poza tym AHSL stanowi specyficzny interfejs pomiędzy minerałem a macierzą organiczną tkanki kostnej, wobec czego może znacząco wpływać na właściwości mechaniczne kości. Jednakże, rejony CPC i AHSL nanocząstek apatytu kostnego w pełnej, niezaburzonej tkance kostnej nie były jeszcze badane.

Cel. Scharakteryzowanie obszarów CPC i AHSL nanocząstek apatytu kostnego beleczkowej tkanki kostnej pobranej od kobiet po menopauzie podczas operacyjnego zabiegu pierwotnej alloplastyki stawu biodrowego.

Materiał i metody. Próbki beleczkowej tkanki kostnej z szyjki kości udowej zostały pobrane od 18 kobiet, w różnym wieku i z różnym T-score (BMD L2-L4), podczas planowego zabiegu alloplastyki stawu biodrowego w Klinice Ortopedii i Traumatologii Narządu Ruchu Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Pobrane próbki (kształt cylindryczny: 10-15 mm długości i 7 mm średnicy) były badane metodą obrazowania protonowego mikroMRI oraz spektroskopią 31P NMR ciała stałego w eksperymencie z nasycaniem i odrostem magnetyzacji. Zostały określone następujące parametry NMR: stosunek BV/TV (ang. bone volume to total volume ratio), stosunek zawartości fosforu w AHSL do zawartości fosforu w CPC (B/A), szerokości połówkowe (FWHM) sygnałów 31P z tych obszarów oraz ich czasy relaksacji spinowo-sieciowej (T1P). Uzyskane korelacje były uznane za istotne statystycznie dla p<0,05.

Wyniki. Nie stwierdzono korelacji parametrów NMR, czyli B/A, FWHM i T1P z parametrami makroskopowymi, takimi jak wiek, T-score czy markerami obrotu kostnego (CrossLaps i osteokalcyna; pomiar z krwi pacjentek). T-score (mierzony z odcinka lędźwiowego kręgosłupa) daje ujemną korelację z BV/TV (pomiar z próbek szyjki kości udowej). Dla obu obszarów, AHSL i CPC, uzyskano dodatnie korelacje T1P oraz ujemne korelacje FWHM ze stosunkiem B/A, którego zakres zmienności wynosił 0,15-0,32.

Wnioski. W badanej grupie pacjentek nie stwierdzono bezpośredniego związku między parametrami makroskopowymi a parametrami minerału kostnego na poziomie molekularnym. Nasze wyniki wskazują na tzw. odwrotną relację pomiędzy osteoartrozą i osteoporozą. Szacujemy, że AHSL zawiera ok. 13-24% fosforu znajdującego się w apatycie. Kiedy rośnie AHSL (wzrasta stosunek B/A), w obu obszarach (AHSL i CPC) ubywa wody i następuje porządkowanie ich struktur. Spektroskopia 31P NMR w ciele stałym okazała się cenną metodą selektywnej analizy minerału kostnego w pełnej tkance kostnej.

P44

CHEMICAL NANO-FEATURES OF BONE MINERAL FROM FEMORAL NECK: A SOLID-STATE PHOSPHORUS-31 NMR STUDY FOR WOMEN WITH OSTEOARTHRITIS AND OSTEOPOROSIS OR OSTEOPENIA

Kaflak A.¹, Chmielewski D.², Kołodziejski W.¹

¹Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej, Wydział Farmaceutyczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny

²Department of Orthopaedic Surgery and Traumatology, HOSPITEN Lanzarote

Key words: osteoarthritis, osteoporosis, bone mineral, nano-apatite, nuclear magnetic resonance

Objectives. Bone mineral consists of apatite nano-particles (platelets, all dimensions below 100 nm) deposited between collagen fibrils. Those particles contain crystalline phosphate core (CPC), which is covered by an amorphous hydrated surface layer (AHSL). This layer is relatively broad, and exerts crucial effect on physicochemical and biological properties of bone apatite. Furthermore, AHSL serves as a specific interface between bone mineral and organic matrix, so it must be somehow responsible for mechanical properties of bone. So far, the CPC and AHSL regions of bone apatite nano-particles in whole intact bone have not been studied.

Aim. Characterization of the CPC and AHSL environments of bone apatite nano-particles from trabecular tissue specimens acquired from postmenopausal women during total hip arthroplasty.

Materials and methods. Trabecular bone from femoral neck was harvested from 18 women of various age and T-score (BMD L2-L4) during surgical operations of alloplastic reconstruction of hip joints (degenerative joint disease), performed in the Department of Orthopaedics and Traumatology of the Locomotor System, Medical University of Warsaw. The biopsy specimens of whole bone (10-15 mm long and 7 mm wide cylinders) were studied using proton microMRI and solid-state 31P NMR with saturation recovery pulse sequence. The following magnetic resonance parameters were determined: the bone volume to total volume ratio (BV/TV), the concentration ratio of phosphorus in the AHSL and CPC locations (B/A), their 31P linewidths (FWHM) and spin-lattice relaxation times (T1P). Statistical correlations were considered significant for p<0.05.

Results. No correlations were found of the B/A, FWHM and T1P NMR parameters with the macroscopic parameters: age, T-score and bone turnover markers (CrossLaps and osteocalcin levels in blood). T-score (lumbar spine) gives negative correlation with BV/TV (femoral neck). For both AHSL and CPC, there are positive correlations of T1P and negative correlations of FWHM with B/A, which value varies from 0.15 to 0.32.

Conclusions. In the examined group there is no direct relationship between the macroscopic and molecular level parameters of bone mineral. Our results indicate an inverse relationship between osteoarthritis and osteoporosis. In AHSL there is 13-24 % of apatite phosphorus. When AHSL grows (B/A increases), both AHSL and CPC become less hydrated and more ordered. Solid-state 31P NMR has proved to be a valuable method to selectively analyze apatite mineral in whole bone.