KWASY AMINOMETYLENOBISFOSFONOWE – SYNTEZA I ZASTOSOWANIE W LECZENIU OSTEOPOROZY
V Środkowo Europejski Kongres Osteoporozy i Osteoartrozy oraz XVII Zjazd Polskiego Towarzystwa Osteoartrologii i Polskiej Fundacji Osteoporozy, Kraków 29.09-1.10.2011
Streszczenia:
Ortopedia Traumatologia Rehabilitacja 2011, vol 13 (Suppl. 1). str 118-119
P16
KWASY AMINOMETYLENOBISFOSFONOWE – SYNTEZA I ZASTOSOWANIE W LECZENIU OSTEOPOROZY
Chmielewska E.1, Kafarski P. 1, Wietrzyk J. 2
1Politechnika Wrocławska Wydział Chemiczny Zakład Chemii Bioorganicznej
2Instytut Immunologii i Terapii Doświadczlanej Polskiej Akademii Nauk Zakład Onkologii Doświadczalnej
Słowa kluczowe: kwasy aminometylenobisfosfonowe, osteoporoza, leczenie
Wstęp. Bisfosfoniany stanowią ważną klasę związków chemicznych, które znalazły zastosowanie w leczeniu chorób związanych z upośledzeniem metabolizmu wapnia, takich jak m in. choroba Pageta, osteoporoza, szpiczak, osteoliza połączona z hiperkalcemią złośliwą, ponieważ wykazują duże powinowactwo do wapnia i dlatego odkładają się w kościach. Bisfosfoniany stanowią najważniejszą grupę leków antyresorpcyjnych. Ulegają adsorpcji na kryształach hydroksyapatytu, co jest powodem ich długiego okresu półtrwania w kościach. Nie opisano jednak w związku z tym żadnego długotrwałego, niepożądanego efektu. Działanie bisfosfonianów polega na inhibicji syntetazy pirofosforany farnezylu. Na powierzchniach resorpcyjnych bisfosfoniany hamują czynność osteoklastów. Mimo iż dokładny molekularny mechanizm działania bisfosfonianów nie został w pełni poznany sadzi się, że bisfosfoniany mogą bezpośrednio oddziaływać na dojrzałe osteoklasty hamując ich aktywność resorpcyjną na skutek zaburzeń w ich ultrastrukturze. Bisfosfoniany, oddziałując bezpośrednio na osteoklasty lub też pośrednio przez hamowanie osteoklastogenezy, nie tylko hamują resorpcję tkanki kostnej, lecz także działając na osteoblasty mogą pobudzać kościotworzenie przyspieszając apoptozę osteoklastów. Bisfosfoniany hamuja proliferację i zmniejszają procent obumierania komórek makrofagowych w testach in vitro. Pokazano, że efekt działania aminometylenobisfosfonianów na komórki makrofagowe polega na indukcji apoptozy.
Cel. Celem pracy jest synteza nowych N-modyfikowanych pochodnych kwasu aminometylenobisfosfonowego o ukierunkowanych właściwościach fizykochemicznych i aktywności biologicznej, analogów inkadronianu jako potencjalnych leków przeciw osteoporozie, a także badania nad aktywnością cytotoksyczną bisfosfonianów osteogennych wobec linii mysich komórek makrofagopodobnych (J774E). Mysia linia makrofagopodobna J774 używana do testu jest szeroko stosowana linią do zinterpretowania aktywności bisfosfonianów.
Materiał i metody. Struktura przestrzenna łańcucha bocznego R2 wyznacza komórkowy wpływ bisfosfonianów i ich względną skuteczność jako inhibitorów resorpcji kości. Działanie bisfosfonianów zależy między innymi od rodzaju rodników przy węglu kwasu bisfosfonowego, długości łańcuchów alifatycznych oraz podstawników w łańcuchach bocznych. Każdy bisfosfonian posiada swój własny profil aktywności, zdeterminowany przez indywidualne właściwości łańcucha bocznego. Reakcja syntezy aminometylenobisfosfonianów polega na trzy-składnikowej reakcji kondensacji pomiędzy aminą I- lub II-rzędową, ortomrówczanem trietylowym i fosforynem dietylowym. Reakcja nie wymaga użycia silnie toksycznych reagentów. Surowe estry aminometylenobisfosfonianów poddaje się hydrolizie kwasem solnym otrzymując odpowiednie kwasy aminometylenobisfosfonowe. Badania skryningowe aktywności bisfosfonianów wykonano przy użyciu testu MTT, mierzącego zahamowanie proliferacji komórek docelowych w 72-godzinnej hodowli in vitro. W badaniach zastosowano mysią makrofagopodobną linie komórkową (J774E). Jako kontrolę zastosowano inkadronian w takich samych stężeniach jak badane związki. Wyniki doświadczeń w postaci ID50 (dawka powodująca zahamowanie proliferacji 50% populacji komórek nowotworowych) oraz procentu zahamowania proliferacji wyznaczono dla każdego związku. Wartości IC50 wyznaczono na podstawie trzech niezależnych eksperymentów.
Wyniki. Zsyntetyzowaliśmy ponad sto aminometylenobisfosfonianów o zróżnicowanej strukturze i zbadaliśmy ich aktywność antyproliferacyjną na mysich makrofagach (linia J774). W teście MTT wybrano związki o najwyższej aktywności. Aktywność wielu jest wyższa niż inkadronianu stosowanego jako związek referencyjny. Wiele aminometylenobisfosfonianów wykazywało aktywność zbliżoną do inkadronianu, a niektóre nie wykazywały aktywności niezbędnej do określenia wartości ID50 w zastosowanych stężeniach. Obecnie trwają badania wybranych bisfosfonianów na proces kościotworzenia u owiec.
Wnioski. Obecnie w farmakologicznym leczeniu osteoporozy najwięcej uwagi poświęca się lekom o właściwościach antyresorpcyjnych, głównie bisfosfonianom. Udało się zsyntezować kwasy aminometylenobisfosfonowe o interesujących właściwościach antyosteoporotycznych. Zostały one skierowane do badań biologicznych w leczeniu indukowanej osteoporozy u owiec. Uzyskane wyniki badań in vivo są zadowalające.
P16
AMINOMETHYLENEBISPHOSPHONIC ACIDS – SYNTHESIS AND THEIR ACTIVITY IN TREATMENT OF OSTEOPOROSIS
Chmielewska E.1, Kafarski P. 1, Wietrzyk J. 2
1Politechnika Wrocławska Wydział Chemiczny Zakład Chemii Bioorganicznej
2Instytut Immunologii i Terapii Doświadczlanej Polskiej Akademii Nauk Zakład Onkologii Doświadczalnej
Keywords: aminomethylenebisphosphonic acids, osteoporosis, treatment
Objectives. Bisphosphonates are an important class of drug molecules, used to treat osteoporosis, Paget’s disease, and hypercalcemia due to malignancy because they are powerful inhibitors of bone resorption. Bisphosphonates have become the most important class of antiresorptive drugs, not only for the treatment of Paget’s disease, but also for other diseases that involve excessive osteoclast-mediated bone resorption, such as tumor-induced osteolysis and hypercalcemia and osteoporosis. They act by inhibiting the enzyme farnesyl diphosphate synthase. Despite this, the molecular mode of their action is still not clear. There is substantial evidence that BPs can have a direct effect on osteoclasts by mechanisms that may lead to osteoclast cell death by apoptosis. BPs can also inhibit proliferation and cause cell death in macrophages in vitro. There is shown that the toxic effect of BPs on macrophages is also due to the induction of apoptotic, rather than necrotic, cell death.
Aim. The aim of our studies is synthesis the aminomethylenebisphosphonic acids, analogs of incadronate, as potential antiosteoporosis drugs. The aim of these studies is the preselection in vitro of BPs in the model cell line to choose potent compounds. The mouse macrophage-like cell line J774 used in this study is a convenient model to identify the activity of BPs.
Materials and methods. Although the structure of the R2 side chain is the major determinant of antiresorptive potency, both phosphonate groups are also required for the drugs to be active. The simplest procedure for preparation of aminomethylenebisphosphonates relays on three-component reaction between primary or secondary amine, triethyl orthoformate and diethyl phosphite, followed by acid hydrolysis. The in vitro cytotoxic effect of all agents was examined after 72-hours of exposure of the cultured cells to varying concentrations of the tested compounds, using the MTT assay. The in vitro results were presented in terms of inhibitory concentration 50% (IC50) values. The IC50 is the concentration of tested agent, which inhibits the proliferation of 50% of the cancer cell population. Average IC50 values for each preparation were calculated using data from three independent experiments.
Results. We synthesized above hundred aminomethylenebisphosphonates with structural variety and tested their antiproliferative activity on the mouse macrophages cell line J774.We choose the most potent compounds selected in this examination. Its activity is higher that that of referential compound incadronate. Some compounds have the best profile of activity (inhibition of proliferation observed in dose-dependent manner).There are also many compounds with similar activity to that of incadronian Now we are testing the most active compounds in vivo.
Conclusions. Nowadays in pharmacotherapy of osteoporosis the most common are antiresorptive drugs, mainly bisphosphonates.
We synthesised the aminomethylenebisphosphonic acidssuccessfully and they have interesting antiosteoporosis activity. The most active bisphosphonates were tested.